Caracterización de la unión específica a macrófagos de péptidos derivados de lipoproteínas de Mycobacterium tuberculosis y análisis de la respuesta inmune

La tuberculosis sigue siendo una de las enfermedades infecciosas de mayor incidencia en salud pública a nivel mundial. Se ha considerado que un tercio de la población mundial se encuentra infectada con el bacilo causante de la tuberculosis pulmonar (Mycobacterium tuberculosis) aunque solo 5 a 10% de la personas infectadas desarrollan la enfermedad. El proceso infeccioso se inicia en las vías respiratorias, siendo los principales blancos las células epiteliales y los macrófagos localizados en los alvéolos pulmonares, este proceso requiere de la interacción patógeno – hospedero. Se han estudiado los eventos que permiten al bacilo evadir la respuesta inmune y la activación apropiada de los macrófagos una vez son infectados y se ha establecido la importancia de la respuesta inmune celular en el control de la enfermedad. En este trabajo se presenta el diseño metodológico que permite la identificación de secuencias derivadas de proteínas de superficie de Mycobacterium tuberculosis H37Rv que podrían estar involucradas en la interacción patógeno hospedero. El análisis in silico del genoma de esta micobacteria permitió la identificación de lipoproteínas que potencialmente podrían localizarse en la superficie de la bacteria. Posteriormente se verificó la presencia de los genes que codifican para las proteínas de interés y su expresión en la cepa de laboratorio, M. tuberculosis H37Rv, bajo condiciones normales de cultivo. A continuación se identificaron las secuencias peptídicas de dichas proteínas que se unían específicamente y con alta afinidad a células blanco de infección y que podrían estar involucradas en su reconocimiento. Como parte de la caracterización funcional de estas secuencias de alta capacidad de unión específica se determinó, en ensayos in vitro, su capacidad de inhibir la entrada de la micobacteria a células blanco de infección así como su capacidad para promueven la internalización de microesferas cubiertas con los péptidos a células no fagocíticas A549. Además se estableció la capacidad de los pooles de péptidos de cada una de las lipoproteínas para inducir una respuesta de linfoproliferación y se determinó el perfil de citocinas secretadas. Finalmente se determinó la capacidad de mismos pooles de péptidos para inhibir el crecimiento intracelular de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, efecto que podría asociarse con el potencial protectivo que pueden presentar los péptidos de las proteínas de interés en el modelo murino. El desarrollo del presente trabajo se fundamenta en los promisorios resultados obtenidos en la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia -FIDIC-, donde se han podido establecer las pautas que permiten el diseño racional de una vacuna subunitaria, multiantigénica, basada en péptidos sintéticos, efectiva contra enfermedades infecciosas como la malaria. A pesar de las diferencias entre estos patógenos, aquí se presentan los resultados aplicando la misma metodología, ahora en la selección de antígenos que potencialmente pudieran ser la base de una vacuna eficiente contra tuberculosisAbstract. Tuberculosis continues being one of the infectious diseases having the greatest incidence regarding worldwide public health. It has been considered that a third of the world’s population are infected with the bacillus causing pulmonary tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis), even though just 5% to 10% of the infected people develop the full-blown disease. Infection begins in the respiratory tract, epithelial cells and alveolar macrophages located in the pulmonary alveoli being the main target; this requires a pathogen–host interaction. The events allowing the bacilli to evade the immune response have been studied, as have the appropriate activation of the macrophages once they have become infected whilst the importance of a cellular immune response in controlling the disease has also been established. This work presents the methodological design which led to the identification of sequences derived from Mycobacterium tuberculosis H37Rv surface proteins involved in the pathogen-host interaction. In silico analysis of this mycobacterium’s genome facilitated the selection of lipoproteins which might possibly formed part of its surface. The presence of genes encoding proteins of interest were then determined, as well as their expression in the M. tuberculosis H37Rv laboratory strain in normal culture conditions. Such proteins’ peptide sequences binding specifically and with high affinity to target cells for the infection were then identified as they could have been involved in its recognition. Part of the functional characterisation of these high specific binding capacity sequences was determined, in in vitro assays, if they inhibited mycobacteria entry to target cells of infection and whether such sequences promoted the internalisation of peptide-covered microspheres in non-phagocytic A549 cells. Their lymphoproliferation induction capacity and cytokine profile were also established, as well as their protective potential as Mycobacterium tuberculosis H37Rv intracellular growth inhibitors which could present peptides from proteins of interest in a murine model, in in vitro assays. The development of the present work was based on promising results obtained at the Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC) where guidelines have been established which have led to the rational design of a subunit, multi-antigen, synthetic peptide-based vaccine which would be effective against malaria. In spite of the differences between these pathogens, an attempt has been made to apply an appropriate methodology for selecting potential antigens to be included in an effective anti-tuberculosis vaccine.Doctorad

Análisis bioinformático del genoma del Mycobacterium Tuberculosis. UNAN-MANAGUA 2008-2009

La bioinformática es la aplicación de tecnología computacional a la gestión y análisis de información biológica, principalmente a nivel molecular. Esto representa un gran potencial para el conocimiento de patologías como la tuberculosis (TB) cuya patogenia es compleja y aún no está totalmente dilucidada, además se encuentra en aumento por la incidencia e incremento de múltiples factores de riesgo, su tratamiento y métodos de diagnóstico se enfrentan a inconvenientes como el desarrollo de cepas multi y extremadamente resistentes y el desarrollo de tuberculosis inespecíficas y/o cuyo agente etiológico no es el Mycobacterium tuberculosis. En este estudio se realizó un análisis bioinformático de los genomas de las cinco cepas secuenciadas en su totalidad y disponibles en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica de Estados Unidos (NCBI), a fin de determinar las familias de proteínas, proteínas virulentas y los procesos específicos que éstas regulan en la patogenia, obteniendo como resultado la identificación de regiones con alto potencial para el desarrollo de drogas antituberculosas como también posibles métodos de diagnóstico. Para dicha selección se tomaron en cuenta parámetros como la especificidad de las proteínas, identidad de la secuencia entre las cepas analizadas, conocimiento de sus dominios, localización al ser expresadas y secreción, entre otros. Producto de lo anterior determinamos que la familia PE es una región ideal para el desarrollo de vacunas, las proteínas Mpt53, Cfp7, proteína de resistencia a antibióticos, y en menor grado la proteína BLAC y la proteína similar a la betalactamasa, son objetivos viables para el desarrollo de drogas antituberculosas. Como potenciales métodos de diagnóstico se identificaron a las familias PPE y PE_PGRS, la proteína Mpt63, Esat 6, Cfp7 y Cfp2. Por otro lado se estableció que la presencia de la pirazinamidasa/nicotinamidasa pncA en los genomas, no es la única responsable de la resistencia a la pirazinamida. La cepa con mayor resistencia a antibióticos es la KZN1435 y la cepa H37Rv es la más completa en cuanto a las proteínas virulentas que codifica. Así mismo se determinó que el segmento IS6110 y las transposasas son los únicos elementos transponibles presente en todas las cepas

Respuesta de las ATPasas tipo P1B a las condiciones de estrés en Mycobacterium tuberculosis

El éxito de Mycobacterium tuberculosis como patógeno se fundamenta en su capacidad de evadir la respuesta inmune del hospedero, sobreviviendo dentro de los macrófagos. En estas células, la micobacteria reside en fagosomas que exhiben una variedad de actividades antimicrobianas como pH ácido, especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS), péptidos antimicrobianos, hidrolasas ácidas, bajo contenido de micronutrientes, y concentraciones no fisiológicas de iones de metales pesados. En este escenario hostil, los transportadores activos de cationes, como las ATPasas tipo P1B, juegan un papel relevante en la homeostasis iónica de la bacteria, al estar relacionados con la desintoxicación de estos metales, y con la respuesta al estrés redox. En el caso de M. tuberculosis, algunas ATPasas tipo P1B se han descrito como factores de virulencia, debido a su papel en la adaptación de la micobacteria al ambiente intracelular. En este orden de ideas, resulta interesante conocer la relación entre la actividad de las ATPasas tipo P1B y las condiciones de estrés que M. tuberculosis soporta durante la infección, con el fin de evaluar el potencial de estos transportadores de membrana en la viabilidad de M. tuberculosis. Para cumplir con este objetivo, el presente trabajo tuvo tres enfoques de estudio diferentes orientados a tener una visión del posible papel de las ATPasas tipo P1B en respuesta a algunas condiciones de estrés que simulan parcialmente el ambiente del fagosoma en el que reside M. tuberculosis. El primero, es el análisis transcripcional de las ATPasas tipo P1B bajo algunas condiciones de estrés al que M. tuberculosis se expone durante la infección. El segundo es la búsqueda de los posibles reguladores transcripcionales de estas ATPasas tipo P1B y la evaluación de su transcripción bajo las mismas condiciones de estrés, para así aproximarse a los potenciales mecanismos de regulación. Finalmente, una aproximación funcional de las tres Cu+ ATPasas putativas de M. tuberculosis, las que representan cerca de la mitad de ATPasas transportadoras de metales pesados en la micobacteria y cuya función se desconoce. Para su análisis se realizó una caracterización funcional de la actividad enzimática de estas tres proteínas, incluyendo análisis bioinformáticos, manipulaciones genéticas y de biología molecular, y finalmente un componente bioquímico para responder a los objetivos propuestos. Se encontró que todas las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis tienen una activación a nivel transcripcional en respuesta a las diferentes condiciones de estrés, como exposición a altas concentraciones de cationes de metales pesados, agentes de estrés oxidativo y nitrosativo, e hipoxia. El análisis transcripcional con cationes de metales pesados mostró que la transcripción de los genes ctpA, ctpG, y ctpV se activa en presencia de Cu2+, ctpC por Zn2+, ctpG por Cd2+ y ctpJ por Co2+. Agentes de estrés oxidativo y nitrosativo activaron la transcripción de los genes ctpA, ctpB, y ctpD, mientras que la hipoxia estimuló la expresión de ctpB y ctpC. Los anteriores resultados muestran que las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis se activan con la presencia de cationes de metales pesados, asociándose con el transporte estos metales y en su desintoxicación celular. También se pudo concluir que estas ATPasas se asocian con la respuesta al estrés redox e hipoxia, ayudando a la célula a responder a estas condiciones adversas. Los resultados del análisis transcripcional de los posibles reguladores transcripcionales de las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis, mostraron una respuesta concertada entre la activación de la transcripción del regulador y la ATPasa tipo P1B, lo que significa que los genes de los reguladores transcripcionales propuestos (rv0818, rv2250c, sigC, rv0324, sigH, rv0238, cmtR, nmtR, y csoR) aumentan sus niveles de expresión en respuesta a las mismas condiciones de estrés previamente establecidos para las ATPasas tipo P1B reguladas. Resulta interesante que M. tuberculosis exprese tres Cu+ ATPasas putativas, de las que se desconoce su función biológica. Nuestra hipótesis es que no se trata de sistemas redundantes de extrusión de cobre, sino que se trata de sistemas independientemente controlados que funcionan bajo condiciones metabólicas particulares de la micobacteria. Los análisis funcionales permitieron establecer que, cómo se esperaba, las tres enzimas tienen al Cu+ como sustrato. Los parámetros cinéticos de estas enzimas se determinaron usando ensayos enzimáticos de actividad Cu+ ATPasa y transporte de Cu+, permitiendo establecer que CtpA y CtpB se relacionan con enzimas encargadas de metalar proteínas extracitoplasmáticas, en tanto que CtpV se relaciona con la desintoxicación de Cu+, necesaria cuando los niveles de cobre intracelular sobrepasan el límite requerido y se vuelven deletéreos para la célula. El conjunto de resultados de este trabajo sugiere que las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis juegan un papel importante en la respuesta a las condiciones de estrés que la micobacteria enfrenta durante la infección, incluyendo altas concentraciones de metales pesados, estrés redox y bajas tensiones de oxígeno.Abstract The success of Mycobacterium tuberculosis as pathogen is based on its ability to evade the host immune response. The bacterium resides inside macrophage phagosomes under an antimicrobial environment, including acid pH, reactive oxygen (ROS) and nitrogen (RNS) species, antimicrobial peptides, acid hydrolases, low micronutrient availability, and non-physiological concentrations of heavy metal cations. In this hostile scenario, membrane transporters such P1B-type ATPases, involved in cation detoxification and response to redox stress, are relevant to survive. Particularly, some mycobacterial P1B-type ATPases have been described virulence factors, due to their role in the adaptation of the mycobacterium to the intraphagosomal environment. To evaluate the potential of P1B-type ATPases in the bacterial virulence, it is important to know the relationship between these membrane transporters and the stress conditions that M. tuberculosis faces during infection. To achieve this goal, this work had three different study approaches. The first one was the transcriptional analysis of P1B-type ATPases under stress conditions that mimic the hostile environment inside phagosomes. The second was the identification of possible transcriptional regulators controlling P1B-type ATPases, by evaluating their transcription behavior under the stress conditions, in an effort to approach to the regulatory mechanisms of P1B-type ATPases. Finally, to gain a better understanding of the possible role of these transporters, the study focused on the 3 putative M. tuberculosis Cu+ ATPases. Those are about a half of the heavy metal transporting ATPases present in the mycobacteria, and all of them are without functional characterization. This characterization was made including, bioinformatic analysis, genetic and molecular biology manipulations, and a biochemical analysis Our analysis showed that all P1B-type ATPases of M. tuberculosis are overexpressed in response to different stress conditions, including high concentrations of heavy metal cations, oxidative and nitrosative stress, and hypoxia. The transcriptional analysis with heavy metal cations showed that the transcription of ctpA, ctpG, and ctpV is activated with Cu2+, ctpC with Zn2+, ctpG with Cd2+, and ctpJ with Co2+. Additionally, oxidative and nitrosative stress promotes transcription of ctpA, ctpB, and ctpD, and hypoxia promotes expression of ctpB and ctpC. This suggests that M. tuberculosis P1B-type ATPases are pivotal in the response to high concentration of heavy metal cations, which is in agreement with their canonical transport/detoxification function. Also, these ATPases are related with the response to redox stress and hypoxia, helping the pathogen to face those adverse conditions. The transcriptional analysis of the possible transcriptional regulators controlling P1B-type ATPases, showed a similar transcriptional response between the transcription regulator and the P1B-type ATPases. The genes of the proposed transcriptional regulators (rv0818, rv2250c, sigC, rv0324, sigH, rv0238, cmtR, nmtR, and csoR) increased their expression in response to the same stress conditions that the stimulated the expression of the P1B-type ATPases. Interestingly, M. tuberculosis possesses three putative Cu+ ATPases. Our hypothesis is that these are not redundant copper extrusion systems, instead, are independently controlled systems responding to specific metabolic conditions. The functional analyzes of those three proteins confirmed that Cu+ is the substrate of the three enzymes. The kinetic parameters determined by enzymatic assays, including Cu+ ATPase activity and Cu+ transport, suggest that CtpB and CtpA are related to enzymes involved in metalation of periplasmic proteins. In contrast, CtpV is homologue to enzymes involved in Cu+ detoxification. The set of results presented in this work suggests that M. tuberculosis P1B-type ATPases play an important role in the mycobacterial response to stress conditions faced during infection.Doctorad

Determinación de características funcionales de CtpG, una ATPasa tipo P transportadora de metales pesados a través de la membrana plasmática de Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el agente etiológico de la tuberculosis (TB). Actualmente, Mtb es el mayor causante de muertes por un agente infeccioso en el mundo. Las principales estrategias para el control de la TB incluyen la quimioterapia, el diagnóstico temprano y la vacunación con el bacilo de Calmette-Guérin (BCG). Sin embargo, el surgimiento de cepas multifármaco resistentes (MDR) y extremadamente fármaco resistentes (XDR) han dificultado el control de la TB. Por lo tanto, se hace prioritario identificar nuevos blancos terapéuticos para así poder desarrollar nuevas alternativas de control. Una de las estrategias que utilizan los macrófagos cuando han fagocitado a Mtb, es aumentar la concentración de metales como hierro, cobre, zinc, potasio, calcio y manganeso, por lo que la micobacteria requiere de sistemas que permitan el eflujo y la detoxificación de metales, para mantener la homeostasis iónica. Específicamente, Mtb codifica 28 genes encargados del transporte de iones metálicos, de los que 12 son genes que codifican ATPasas tipo P que se expresan diferencialmente durante la infección, una amplia cantidad, respecto a otros patógenos intracelulares. Las ATPasas tipo P son enzimas que catalizan el transporte de cationes metálicos en contra del gradiente de concentración, a partir de la hidrólisis del ATP. Su expresión es fundamental para la viabilidad celular debido a su participación en procesos de detoxificación, metalación de otras proteínas y en respuesta a estrés oxidativo. Su localización transmembranal, las hace un blanco terapéutico más accesible a los fármacos, respecto a blancos citoplasmáticos. Se ha reportado que CtpG, una ATPasa tipo P1B, se induce durante la infección de Mtb en macrófagos humanos, en condiciones de hipoxia, inanición y en presencia de sustancias tóxicas como altas concentraciones de metales pesados (Cu2+-500 µM y Zn2+-500 µM) que afectan la viabilidad de Mtb. Adicionalmente CmtR, el regulador transcripcional de ctpG, es sensado por Cd2+ en Mtb H37Rv, lo que sugiere que CtpG podría ser una bomba encargada del eflujo de este metal tóxico. Por todo lo anterior, CtpG podría ser un blanco terapéutico interesante, por lo que se hace importante conocer muchas de sus características funcionales. En el presente trabajo se propuso determinar algunas características de CtpG como la especificidad iónica en membrana de micobacterias, y el comportamiento transcripcional en presencia de concentraciones subletales de metales pesados posiblemente transportados por esta enzima. Además, se desarrollaron herramientas para la producción de anticuerpos policlonales contra CtpG. La expresión de CtpG recombinante se optimizó usando el sistema pBAD A Myc His, en E. coli LMG194. La proteína se expresó en la fracción soluble utilizando 0.3% de L- arabinosa y 8 horas de inducción a 20°C. Así mismo la mayor parte de la proteína se detectó en la fracción insoluble como cuerpos de inclusión en todas las condiciones de cultivo analizadas. Se encontró que los iones Cu2+, Co2+, Cd2+ y Pb2+ inducen la actividad enzimática mediada por CtpG en la membrana plasmática de micobacteria, con valores de 6.25 ± 1.429, 4.1266 ± 0.914, 6.5705 ± 1.694 y 6.2099 ± 1.745 U/mg de proteína, respectivamente. Para hacer un acercamiento a la especificidad iónica, se realizaron ensayos de tolerancia a concentraciones tóxicas de metales pesados en M. smegmatis mc2155 sobreexpresando CtpG. Se encontró que CtpG genera tolerancia a Cd2+ y Cu2+ en células completas de micobacteria. De acuerdo a estos resultados, se determinaron las constantes cinéticas de la proteína recombinante utilizando Cd2+ (Vmáx: 0,856 ± 0,01y Km: 0,108 ± 0,007) y Cu2+ (Vmáx: 1,051 ± 0,155 y Km: 0,981±0,422) como sustratos. Esto permitió apreciar que los iones Cd2+, podrían ser más eficientemente transportados por CtpG.Abstract. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is the etiologic agent of tuberculosis (TB). Mtb is currently the largest cause of death by an infectious agent in the world. Key strategies for TB control include chemotherapy, early diagnosis and vaccination with the Bacillus Calmette-Guérin (BCG). However, the emergence of resistant multidrug resistant (MDR) and extremely drug resistant (XDR) strains has undoubtedly made TB control difficult. Therefore, it is a priority to identify new therapeutic targets in order to develop new control alternatives. One of the strategies used by macrophages when they have phagocytosed Mtb is to increase the concentration of metals such as iron, copper, zinc, potassium, calcium and manganese, so the mycobacteria requires systems that allow efflux and detoxification of metals, to maintain ionic homeostasis. Specifically, Mtb encodes 28 genes responsible for the transport of metal ions, of which 12 are P-type ATPases expressing differentially during infection, a large amount, relative to other intracellular pathogens. The P type ATPases are enzymes that catalyze the transport of metallic cations generally against the concentration gradient, from the hydrolysis of ATP. Its expression is fundamental for cell viability due to its participation in processes of detoxification, metalation of other proteins and in response to oxidative stress. Their transmembrane location makes them a therapeutic target more accessible to drugs than cytoplasmic targets. CtpG, a P1B-type ATPase, has been reported to be induced during Mtb infection in human macrophages under conditions of hypoxia, starvation and in the presence of toxic substances such as high concentrations of heavy metals (Cu2+ -500 μM and Zn2+ -500 μM) that affect the viability of Mtb. In addition CmtR, the ctpG transcriptional regulator, is Cd2+ sensitive in Mtb H37Rv, suggesting that CtpG could be a pump responsible for the efflux of this toxic metal. For all of the above, CtpG could be an interesting therapeutic target, so it becomes important to know many of its functional characteristics. In the present work it was proposed to determine some characteristics of CtpG as the membrane ionic specificity of mycobacteria, and the transcriptional behavior in the presence of sublethal concentrations of heavy metals possibly carried by this enzyme. In addition, tools were developed for the production of polyclonal antibodies against CtpG. Expression of recombinant CtpG was optimized using the pBAD A Myc His system in E. coli LMG194. The protein was expressed in the soluble fraction using 0.3% of L-arabinose and 8 hours of induction at 20 ° C. Likewise, most of the protein was detected in the insoluble fraction as inclusion bodies in all culture conditions analyzed. It was found that the Cu2+, Co2+, Cd2+ and Pb2+ ions induce the CtpG-mediated enzyme activity in the mycobacterial plasma membrane, with values of 6.25 ± 1429, 4.1266 ± 0.914, 6.5705 ± 1.694 and 6.2099 ± 1.745 U / mg protein, respectively. To approach the ionic specificity, tolerance tests were performed at toxic concentrations of heavy metals on M. smegmatis mc2 155 overexpressing CtpG. It was found that CtpG generates tolerance to Cd2+ and Cu2+ in whole mycobacterial cells. According to these results, the kinetic constants of the recombinant protein were determined using Cd2+ (Vmax: 0.856 ± 0.01 and Km: 0.108 ± 0.007) and Cu2+ (Vmax: 1.051 ± 0.155 and Km: 0.981 ± 0.422) as substrates. This allowed to appreciate that the Cd2+ ions, could be more efficiently transported by CtpG.Maestrí

Clonación y determinación de la especificidad iónica de CtpA, una ATPasa tipo P encargada de transportar metales pesados a través de la membrana plasmática de Mycobacterium tuberculosis

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa que representa uno de los mayores retos de salud pública en el mundo. Actualmente, su tratamiento no es efectivo debido al surgimiento de cepas de Mycobacterium tuberculosis (agente etiológico de la enfermedad) resistentes a los fármacos antituberculosos convencionalmente utilizados. Tradicionalmente las enzimas de la membrana plasmática se han asociado con los fenómenos de resistencia en bacterias debido que algunas de ellas se encargan del eflujo de sustancias toxicas. Entre ellas, las ATPasas tipo P1B han sido de gran interés debido a que están involucradas en el transporte de metales pesados que afectan el crecimiento celular. En el caso de algunas bacterias patógenas, algunas ATPasas tipo P1B se han considerado como posible factores de virulencia debido a su papel en la adaptación que del patógeno en el ambiente intracelular. En comparación con otros sistemas bacterianos el genoma de M. tuberculosis H37Rv (cepa de referencia) contiene un gran número de ATPasas tipo P1B. Mediante herramientas bioinformáticas ha sido posible realizar una aproximación para conocer los sustratos transportados por estas enzimas, logrando de esta forma identificar la relación de las proteínas CtpA, CtpB y CtpV con el transporte de Cu+; el de CtpC y CtpG con el transporte Zn2+; y el de CtpD y CtpJ con el transporte de Co2+. Estudios anteriores han reportado que ctpA hace parte del grupo de genes que M. tuberculosis sobreexpresa durante la infección in vivo. Específicamente se evidenció el aumento de la expresión del gen ctpA en cepas de M. tuberculosis multiresistentes y extremadamenteresistentes productoras de TB pulmonar o extrapulmonar, sugiriendo que CtpA es una enzima importante para el progreso de la infección tuberculosa. El objetivo del presente proyecto ha sido conocer la especificidad iónica de CtpA, encaminado a conocer su posible papel en la dinámica de infección tuberculosa. Los resultados obtenidos han mostrado que la sobreexpresión heteróloga de CtpA de M. tuberculosis le induce a M. smegmatis mc2155 tolerancia a niveles tóxicos de Cu2+ (4 mM). Se postula que posiblemente el Cu2+ que ingresa a la micobacteria es reducido a Cu+ debido al carácter fuertemente reductor del interior celular; además que una vez reducido el Cu sufre un eflujo al exterior de la micobacteria. Por otro lado, ensayos de actividad ATPasa mostraron que la presencia de Cu+ (4,9 U/mg de proteína) y Ni2+ (2,1 U/mg de proteína) estimula la actividad ATPasa en vesículas de membrana plasmática de M. smegmatis enriquecidas con CtpA. Finalmente, se determinaron los parámetros cinéticos de la actividad de CtpA sobreexpresanda en vesículas de membrana, encontrando que la enzima presenta condiciones óptimas de reacción enzimática a 37 °C y un pH de 7,9. Se encontró que las contantes cinéticas aparentes de CtpA son K1/2 de 4,68 x 10-2 μM de Cu+, Vmax 10,3 U/mg de proteína y h de 1,91. El conjunto de resultados obtenidos sugieren que CtpA es una Cu+ ATPasa tipo P que tiene como función desintoxicar a la célula cuando se enfrenta a niveles letales de Cu+. Adicionalmente, se construyó un sustrato de intercambio alélico y la cepa de recombinería para obtener una cepa mutante defectiva en el gen ctpA de M. tuberculosis H37Ra, mediante la técnica de recombinería, que en un futuro cercano permitirá contrastar los resultados obtenidos en el presente trabajo, y ampliar acerca del transporte de Cu+ mediado por ATPasas tipo P en M. tuberculosis H37Rv.Abstract. Tuberculosis is an infectious disease that represents a major public health challenges in the world. Currently, treatment is not effective due to the emergence of strains of Mycobacterium tuberculosis (etiologic agent of the disease) resistant to anti-tuberculosis drugs conventionally used. Traditionally, plasma membrane enzymes have been associated with the incidence of resistance in bacteria because some of them are responsible for the efflux of toxic substances. Among them, the P1B-type ATPases have been of great interest because they are involved in the transport of heavy metals that affect cell growth. In the case of some pathogenic bacteria, some P1B-type ATPases are considered as virulence factors due to its role in the adaptation of the pathogen in the intracellular environment. Compared to other bacterial systems the genome of M. tuberculosis H37Rv (reference strain) contains a large number of P1B-type ATPases. With bioinformatic tools has been possible to make an approach for substrates delivered by these enzymes, thereby achieving identify the relationship of proteins CtpA, CtpB and CtpV with Cu+ transport, the CtpC and CtpG with Zn2+ transport, and the CtpD and CtpJ with Co2+ transport. Previous studies have reported that CtpA is part of a group of genes that are overexpressed during M. tuberculosis infection in vivo. Specifically showed an expression increase of the ctpA gene in pulmonar TB and extrapulmonar TB infected with multi-drug-resistance-tuberculosis and extensively-drug-resistance-tuberculosis strains, suggesting that CtpA is an important enzyme for tuberculosis infection. The aim of this project was to determine the ionic specificity of CtpA, pointed at knowing their possible role in the dynamics of tuberculosis infection. The results have shown that M. tuberculosis CtpA heterologous overexpression induces toxic levels of Cu2+ (4 mM) tolerance to M. smegmatis mc2155. It is postulated, when the Cu2+ enters to the mycobacteria is reduced to Cu+ due to a strongly reducing environment in the cell cytosol, and then undergoes the Cu efflux outside of the mycobacteria. On the other hand, ATPase activity tests showed that the presence of Cu+ (4.9 U/mg protein) and Ni2+ (2.1 U/mg protein) stimulates ATPase activity in plasma membrane vesicles of M. smegmatis enriched with CtpA. Finally, CtpA kinetic parameters were determined, finding that the enzyme has optimum enzymatic reaction at 37 °C and a pH of 7.9. It was found that the CtpA apparent kinetic constants are K1/2 4.68 x 10-2 μM of Cu+, Vmax of 10.3 U/mg protein, and h of 1.91. The results obtained suggest that CtpA is a Cu+ P-type ATPase whose function is to detoxify the cell when it faced with lethal levels of Cu+. Additionally, an allelic exchange substrate and a M. tuberculosis H37Ra recombineering strain were constructed to obtain a mutant strain defective in the ctpA gene using the recombineering technique, which in the near future will compare the results obtained in this work, and expand on Cu+ transport mediated by P-type ATPases in M. tuberculosis H37Rv.Maestrí

ATPasas tipo P de Mycobacterium tuberculosis como dianas para el diseño racional de compuestos antituberculosos

Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by the acid-fast bacillus Mycobacterium tuberculosis (Mtb), which is one of the most important public health problems worldwide. Furthermore, the emergence of resistant Mtb strains to current anti-TB drugs has increased the search for alternative therapeutic targets and methods for the rational design of new effective drugs. In this sense, membrane proteins have been considered interesting targets due to their biological implication and for being highly accessible to active compounds. Particularly, P-type ATPases membrane transporters are interesting targets due to their implication in ionic homeostasis and mycobacterial viability. This work was oriented to CtpF, a calcium P-type ATPase, related to a broad number of biological conditions associated to processes of infection such as oxidative stress, adaptation of tubercle bacilli to anaerobic conditions, hypoxia and latency. Due to that, the main objective of this doctoral Thesis was to determine, through in silico and in vitro analysis, the potential of P-type ATPases of Mtb, especially the calcium transporter CtpF, as a target for the rational design of anti-TB compounds. Initially, a 3D homology model of CtpF was generated, which was employed for identified key pharmacophoric features of the CtpF-cyclopiazonic acid (CPA) complex, a well-known inhibitor of the sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA1a), from which its 3D structure is known experimentally and was used as a template in the construction of the model. By using a repertoire of experimental techniques, it was evaluated and found that CPA causes inhibition of the Ca2+-ATPase activity of CtpF, as well as mycobactericidal activity. The analysis of the transcriptional response of P2 ATPases to treatment with CPA showed a specific response of ctpF in comparison with other P-type ATPases. These initial results provide evidence that CtpF is a molecular target for the design of compounds with anti-TB potential. Thereupon, with the CtpF-CPA pharmacophoric features, a pharmacophore-based virtual screening was performed using the ZINC database in order to select candidate molecules to inhibitors of CtpF. Molecular docking-based virtual screening and binding free energy calculations (MM-GBSA) of selected candidates allowed identifying six compounds with the best relative binding energies to be evaluated in vitro. The compounds selected displayed in vitro antimycobacterial activity, showing a minimum inhibitory concentrations (MIC) ranging from 50 -100 μg/mL, and growth inhibitions of 29.5 - 64.0 % on Mtb. Likewise, they causes inhibition of Ca2+-ATPase activity in Mtb membrane vesicles (IC50) ranging from 4.1 - 35.8 μM. Finally, the activity of the compounds with the best biological activity was evaluated in a macrophage infection model, as an approach to evaluate the effect of compounds once the infection has occurred. The compound ZINC63908257 was the best candidate by displaying a MIC of 50 μg/mL, a Ca2+ P-type ATPase inhibition with IC50 = 4.4 μM and 81 % decrease in Mtb replication within macrophage. This compound showed cytotoxic activity of 12.9 % in MH-S cells and hemolysis of 2 % of human erythrocytes, thus, this compound shows a good pharmacokinetic profile (drug-like). Overall, the results presented here shows the importance of the P-type ATPases of Mtb for the mycobacteria survival during infection, and identify the CtpF as a key molecular target for the design of new antituberculous compounds.La Tuberculosis (TB) es una enfermedad infectocontagiosa causada por el bacilo ácido-alcohol resistente Mycobacterium tuberculosis (Mtb). A su vez, la TB es un problema muy relevante de salud pública a nivel mundial. Por otra parte, la aparición de cepas de Mtb resistentes a los fármacos antituberculosos actualmente empleados, ha impulsado la búsqueda de dianas terapéuticas alternativas y metodologías para el diseño racional de nuevos fármacos efectivos. En ese sentido, las proteínas de membrana son considerados blancos de interés al ser mayormente accesibles a los compuestos activos. Particularmente los transportadores de membrana ATPasas tipo P son dianas interesantes por su implicación en la homeóstasis iónica y la viabilidad de las micobacterias. El presente trabajo se orientó en CtpF, una ATPasa tipo P de Mtb transportadora de Ca2+, relacionada con una gran cantidad de condiciones biológicas asociadas al proceso de infección tales como estrés oxidativo, la adaptación del bacilo tuberculoso a condiciones anaeróbicas, hipoxia y latencia. Por lo anterior, el objetivo principal de esta Tesis fue determinar mediante análisis in silico e in vitro el potencial de las ATPasas tipo P de Mtb, especialmente el trasportador de calcio CtpF, como diana para la búsqueda racional de compuestos con actividad antituberculosa. Inicialmente se generó un modelo 3D de CtpF por homología, el que fue empleado para identificar las características farmacofóricas del complejo CtpF-ácido ciclopiazónico (CPA), un inhibidor de la Ca2+-ATPasa de retículo sarco-endoplásmico (SERCA1a), de la que se conoce experimentalmente su estructura 3D, y fue usada como plantilla en la construcción del modelo. Utilizando un repertorio de técnicas experimentales, se evaluó y encontró que CPA causa inhibición de la actividad Ca2+-ATPasa de CtpF, así como actividad micobactericida. El análisis de la respuesta transcripcional de los genes de las ATPasas tipo P2 al tratamiento con CPA, mostró una respuesta específica de ctpF en comparación a otras ATPasas tipo P. Estos resultados iniciales permitieron sugerir a CtpF como una diana molecular para el diseño de compuestos con potencial anti-TB. A continuación, con las características farmacofóricas CtpF-CPA se realizó un cribado virtual basado en farmacóforo utilizando la base de datos ZINC, para seleccionar moléculas candidatas a inhibidores de CtpF. Estudios de acoplamiento molecular y cálculos de MM-GBSA de los candidatos permitieron la identificación de seis compuestos con la mejor energía libre de unión para ser evaluados in vitro. Los compuestos finalmente seleccionados demostraron tener actividad antimicobacteriana mostrando una concentración mínima inhibitoria (CMI) entre 50 - 100 μg/mL, e inhibición del crecimiento de Mtb entre el 29.5 - 64.0 %. De manera similar, causaron inhibición de la actividad Ca2+-ATPasa en vesículas de membrana de Mtb con un rango IC50 entre 4.1 - 35.8 μM. Finalmente se evaluó la actividad de los compuestos con mejor respuesta biológica, en un modelo de infección de macrófagos, como un acercamiento al efecto de los compuestos en la sobrevida de Mtb durante la infección. El compuesto ZINC63908257 fue seleccionado como el candidato más activo con una CMI de 50 μg/mL, inhibición de la actividad Ca2+-ATPasa con IC50 = 4.4 μM y disminución del 81 % de la replicación intracelular de Mtb en macrófagos una vez ocurrida la fagocitosis. Este compuesto demostró un efecto citotóxico del 12.9 % en células MH-S y hemólisis del 2 % de glóbulos rojos humanos, además de presentar propiedades farmacocinéticas adecuadas (drug-like). El conjunto de resultados obtenidos muestra la importancia de las ATPasas tipo P de Mtb para la supervivencia del bacilo durante la infección, e identifican la proteína CtpF como una diana molecular clave para el diseño de nuevos compuestos antituberculosos.Proyecto DIB_2016_Numero_35885 y Colciencias Programa Nacional en Ciencias Básicas-Cod. 110171250419Búsqueda racional de compuestos inhibidores de la actividad ATPasa tipo P de membrana plasmática y determinación de su actividad antimicobacteriana.Doctorad

Análisis de mutaciones en los genes asociados a la resistencia a antituberculosos de primera línea en aislados colombianos de Mycobacterium tuberculosis

La tuberculosis (TB) es una de las enfermedades infecciosas responsables de las mayores tasas de morbi-mortalidad a nivel mundial. El tratamiento acortado estrictamente supervisado (TAES) o también conocido como tratamiento corto directamente observado (DOTS) recomendado por la Organización de la Salud (OMS) incluye los antibióticos isoniazida, rifampicina, pirazinamida, estreptomicina y etambutol. Lamentablemente, el TAES no es una opción terapéutica en infecciones con cepas de M. tuberculosis multirresistentes (TB-MDR), menos aun si la enfermedad es causada por cepas extremadamente resistentes (TB-XDR), que son resistentes incluso a medicamentos de segunda línea.1. Resumen 1 2. Introducción 2 3. Marco Teórico 4 3.1 Tuberculosis 4 3.2 Agente causal 4 3.3 Mecanismo de transmisión de Tuberculosis pulmonar 5 3.4 Factores de riesgo 6 3.5 Tratamiento contra la TB 7 3.6 Definición y causas de resistencia a drogas 9 3.7 Resistencia a fármacos de primera línea y mecanismos moleculares de resistencia en m. tuberculosis 11 3.7.2 Resistencia a Isoniazida (INH) 12 3.7.3 Resistencia a Rifampicina (RIF) 13 3.7.4 Resistencia a Pirazinamida (PZA) 14 3.7.5 Resistencia a Estreptomicina (PZA) 15 3.7.6 Resistencia a Etambutol (PZA) 16 3.8 Ensayos Genéticos Para Detección De Resistencia A Fármacos 17 3.9Antecedentes 18 4. Objetivos 24 4.1 Objetivo General 24 4.2 Objetivos específicos 24 5. Materiales y métodos 25 5.1 Obtención de las muestras 25 5.2 Prueba de Susceptibilidad a los fármacos 25 5.3 Extracción y cuantificación de ADN 25 5.4 Diseño de los Cebadores para la amplificación de los genes asociados a Fármaco Resistencia 26 5.5 Amplificación de los genes asociados a Fármaco Resistencia 26 5.6 Análisis de las secuencias obtenidas por secuenciación 27 5.7 AS-PCR 28 6. Resultados 29 6.1 Prueba de Susceptibilidad a los Fármacos 29 6.2 Extracción de ADN, Amplificación y Secuenciación de los genes asociados a Resistencia en Mycobacterium tuberculosis 30 6.3 Secuenciación de rpoB, embB, rpsL, mabA-INHA, katG, pncA, en M. tuberculosis 31 6.3.2 rpoB 32 6.3.3 embB 32 6.3.4 rpsL 33 6.3.5 mabA-InhA .33 6.3.6 katG 33 6.3.7 pncA 35 6.4 AS-PCR 36 7. Discusión 38 8. Conclusiones 43 9. Recomendaciones 44 10. Bibliografía 45PregradoBiólog